試劑Ａ                   200mL

試劑D                     200mL

樣本稀釋液（贈品）     200mL

清洗液（贈品）         200mL

全過程樣本、試劑及實驗環境均需在20±2℃的條件下進行。首先取抗凝血按體積比1:1的比例加全血及組織稀釋液混勻，根據稀釋后的樣本量大小，分以下兩種情況：

情況A: 稀釋后血液樣本小于5mL時，實驗方法如下： 

1. 取一支15ml離心管，依次小心加入試劑A、試劑D（體積比為3:2，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等。如稀釋后的血液樣本為5ml，則先后加入試劑A 3ml、試劑D 2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上，400-550g，離心20-30min（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離 心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。 

3. 離心后，此時離心管中由上至下分為五層。第一層為稀釋液層。第二層為透明試劑D液層。第三層為環狀乳白色單核細胞層。第四層為透明試劑A液層。第五層為紅細胞層。 

4. 用吸管小心吸取第二層試劑D層和第三層乳白色細胞層到另一15ml離心管中，往所得離心管中加入10ml清洗液，混勻細胞。 

5. 250g，離心10min。 

6. 棄上清。 

7. 用吸管以5ml清洗液重懸所得細胞。 

8. 250g，離心10min。 

9. 重復6、7、8，棄上清后以0.5ml后續實驗所需相應液體重懸細胞。 

10. 差異貼壁法純化細胞 

（1） 用單核細胞無血清培養基或單核細胞完全培養基以1.5-3×106個/ml的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞板或細胞瓶中，放于37℃二氧化碳培養箱中進行貼壁培養。 

（2） 2-4小時內貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。 

（3） 10-24小時內貼壁的單個核細胞為內皮、內皮祖細胞、干細胞。 

（4） 不貼壁的為淋巴細胞。

注： 

a) 無血清培養基中不含任何動物成分，為得到更佳培養效果可添加10%自體血漿或2-8%的胎牛血清。 

b) 完全培養基中含2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養的目的細胞而定）。 

c) 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。 

情況B: 血液樣本大于等于5mL時，實驗方法如下： 

1. 取一支適當的離心管，依次小心加入試劑A、試劑D（試劑A與試劑D體積比為5:3，試劑總量與稀釋后的樣本量相等），制成梯度界面。 

2. 將經稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上，450-650g（最大離心力可至1000g），離心20-30min。（注：根據血液樣本量確定離心條件，血液量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果。加入血液樣本后，樣本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二）。 

3. 剩余步驟同“情況A”中步驟3至步驟10。 

注意事項：

1. 全過程樣本、試劑及實驗環境均需在20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結果，最好在取血2h內進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過6h后 分離效果更差甚至不能達到分離目的。 

2. 稀釋后血液樣本體積小于3ml時，試劑A和試劑D用量分別為2ml和1ml。 

3. 本實驗最好不要使用高聚合材質（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面，影響細胞分離效果。 

4. 吸取過多的單核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加。 

5. 吸取過多的單核細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。