內毒素(endotoxin)原稱熱原，是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜及其它微生物細胞壁的主要組成成分，其化學本質為脂多糖，主要由O-特異性鏈、核心多糖和類脂A三部分組成。脂多糖共價連接到非極性的疏水性類脂A(Lipid A)形成帶負電荷的大分子，同時還具有一個親水性的寡糖核，因而具有疏水和親水雙重性質。制備質粒DNA和重組蛋白時，細菌破壁之后將釋放大量脂多糖。無論是普通制備純化程序，還是離子交換、凝膠排阻過濾，甚至是氯化銫超速離心等高級制備程序，脂多糖任不可避免地與DNA或蛋白質牢固結合而被共同純化。脂多糖具有強烈的免疫活性和細胞毒性，并能產生多種復雜的細胞生物學效應，大多數情況下會明顯干擾并產生不可預測的實驗結果。例如在DNA轉染實驗中，內毒素競爭性干擾轉染試劑與DNA的結合，顯著降低轉染效率，并產生明顯細胞毒性降低外源基因表達水平。

本公司生產的內毒素清除劑主要用于清除DNA、蛋白質或其他液體樣品中的內毒素。在特定的pH值、鹽濃度和溫度條件下，內毒素清除劑能與DNA、重組蛋白以及液體樣品中的內毒素特異性結合，經過室溫高速離心后，DNA或蛋白質等保留在水相，而內毒素則被濃縮到極小體積的下層相而被清除。經過3次以上重復抽提后可將活性為5000～50000 EU/ml的內毒素水平降低到5～0.5 EU/ml以下，即降低1000～10000倍。本試劑4℃可儲存半年，-20℃長期儲存。

操作步驟：

提取前請將內毒素清除劑放在冰上冰浴5min，期間翻轉瓶子數次使試劑均勻預冷。

1、a)已純化的質粒DNA內毒素清除：吸取500μl DNA溶液于微型離心管，加入1/10體積3M NaAc pH5.2或1/20體積5M NaCl溶液，冰浴5min。

   b)在提取質粒DNA過程中清除內毒素：以堿裂解法提取質粒為例，在加入裂解液和中和液并離心去除碎片之后，吸取含質粒DNA的上清于新離心管中，冰浴5min。

2、加入1/5體積預冷的內毒素清除劑，振蕩混勻，溶液變渾濁。

3、冰浴5min，溶液應變清亮。

4、37℃水浴5min，不時振蕩，溶液又變渾濁。

5、12000rpm室溫離心5min，溶液應分為兩相，上層水相含DNA，下層油狀相含內毒素。

6、將含DNA的上層水相轉移到新管，棄油狀相，重復抽提三次，即重復步驟2-6三次。

7、加入2.5體積無水乙醇，-20℃沉淀30min或過夜；12000rpm離心10min，棄上清；加入70％乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min棄上清；空氣干燥沉淀，加入100～200μl無內毒素的高純水或TE溶解沉淀。

8、用內毒素檢測試劑測定樣品中內毒素活性，并與初始樣品比較。

注意事項：

1、DNA濃度>1mg/ml時清除內毒素效率降低。由于DNA和蛋白質本身的性質，清除程序可導致10-20％DNA丟失，所幸的是與清除內毒素的艱難相比DNA更容易提取制備。

2、所有溶液應用無內毒素的高純水配制，所有器械材料均應不含內毒素，玻璃器皿可高溫烘烤，非揮發性水溶液可高壓120℃高溫處理。